ботулиническцй і інш.), то специфічні антитіла нейтралізували його. У організмі відбувається нейтралізація тільки вільного, токсину, що не зв'язався з клітками. Знешкодження токсину в ході фізико-хімічної реакції нейтралізації відбувається за рахунок скріплення його вільних аминогрупп, що приводить до втрати токсичности. Якщо антигеном служить вірусний матеріал, нейтралізуючі антитіла повністю придушують специфічну активність вірусу, що виявляється в різних югеточних культурах, курячих ембріонах і на піддослідних тваринах. Вірус перестає розмножуватися, втрачає свою инфекционность.

Р е а до ц і і а г г л ю т і н а ц і і (РА). Розрізнюють пряму непряму, або пасивну агглютинації. У прямий агглютинації в якості антиген виступає сама мікробна клітка або структурні компоненти її поверхневої оболонки. Межа чутливості реакщії агглютинації мікробів становить 0,01 мкг азоти білка антитіл в 1 мл.

Аглютинація зумовлена в більшій мірі особливостями будови клітинної оболонки і її функціями, ніж властивостями агглютининов Fab-фрагменти антитіл можуть блокувати антигенні детермінанти не приводячи безпосередньо до склеювання. Агглютинації сприяє розташування антигенних рецепторов клітинної поверхні у вигляді скупчень. Якщо багатовалентні агглютинини взаємодіють одночасно з декількома антигенними рецепторами, константа Ка підвищується в порівнянні з Ка для випадків соединення антитіла з антигеном одиничним зв'язком.

При пасивної агглютинації розчинні антигени (білки, полисахариди і їх комплекси мікробного походження) сполучаються з нерозчинним носієм, що виконує виключно індикаторну функцію. Носіями можуть бути еритроцити, частинки латекса, полиакриламида бентонита і інш. Скріплення антиген з носієм відбувається внаслідок адсорбції або хімічної взаємодії. Мікробні полисахариди наприклад, адсорбуються на нативних еритроцитах без якої-небудь їх заздалегідь обробки. Різні білки (в тому числі мікробні фрагменти) можливо приєднати до еритроцитів, тільки обробивши їх різними хімічними речовинами що володіють дубильною дією, - танином, хромахлоридом формальдегидом або бисдиазотированним бензидином. Така обробка запобігає руйнуванню еритроцитів, яке може статися при безпосередньому їх контакті з антигеном. При умові, якщо антиген, пов'язаний з носієм, відповідає антитілу, відбувається аглютинація.

Реакція преципітації (РП). Реакція антиген - антитіло представлена преципітацією. Заснована на осадженні антиген з розчину специфічними антитілами. Комплекс антиген антитіло випадає в осадок тільки при певних співвідношеннях концентрацій реагуючих молекул. Область цих співвідношень, при яких в надосадочной рідині після утворень преципітату не обнаружмваются ні вільні антигени, ні вільні антитіла, називається зонойеквивалентности. Поза цією зоною,

при надлишку антитіл або антиген, феномен преципітації не відбувається оскільки утвориться розчинний комплекс антиген - антитіло Реакція преципітації менш чутлива, ніж реакція агглютинації.

Існують модифікації реакції преципітації. Самий простий спосіб постановки - колъцепреципитация, яку виконують в пробірках шляхом нашарування на імунну сироватку різного розведення прозорого розчину антиген. На межі двох реагуючих систем через певний час з'являється опалесцирующее сіро-біле кільце преципітації. Саме таким чином при вивченні стерильних фяльтратов бульйонний культур збуджувачів холери, брюшного тифу, чуми, сибірської виразки і відповідних антисивороток в кінці XIX століття (1897) були виявлені преципитини.

Реакція преципітації може бути поставлена в агаровом геле (иммунодиффузия по Ухтерлоні). Принцип цього методу полягає в наступному. Розчинні антигени і антитіла вносять в лунка, вирізану в геле на певній відстані. Компоненти реакції диффундируют в шарі агара назустріч один одному, утворюючи в зоні контакту преципітат у вигляді каламутної видимої лінії преципітації.

Для більш детальних иммунологическях досліджень застосовують метод иммуноелектрофореза, запропонований П. Грабаром і К. А. Уїльямсом (1953). Спочатку здійснюють електрофоретическое розділення антиген, що являє собою часто суміш білкових або інших молекул в забуференном агаровом геле. Після розділення в канавку, яка йде в напрямі міграції антигенних речовин, вносять преципитирующую сироватку. Антиген і антисироватка диффундируют в геле назустріч один одному, і в місці їх взаємодії виникають дугоподібні лінії преципітації. По числу, положенню і формі цих ліній дають висновок про склад початкової суміші антигенів.

Реакція лизиса (РЛ). Лизирующее (розчинювальне) дія антитіл наочно виявляється в реакціях лизиса і скріплення комплемента. У основі реакцій лизиса лежить взаємодія корпускулярних антигенів зі специфічними антитілами. Иммуноглобулини при сприянні комплемента руйнують еритроцити, з яких вийде гемоглобін, і реагуюча суміш з каламутної взвеси еритроцитів перетворюється в прозору червону рідину, так звану лакову кров. Реакція названа реакцією гемолиза. Коли иммуноглобулини таюке при сприянні комплемента руйнують оболонку бактерійної клітки, спостерігається лізис бактерій - бактериолизис.

Реакція скріплення комплемента (РСК). Механізм дії найбільш складний в порівнянні з іншими серологическими реакціями. У РСК беруть участь дві системи антиген - антитіло. Для візуальної реєстрації скріплення комплемента основною системою антиген - антитіло в реакцію додатково вводять другу, або індикаторну, систему, що складається з взвеси еритроцитів і відповідної антисиворотки (гемолитической сироватки). Якщо

основний комплекс антиген - антитіло фіксував в собі комплемент (у разі відповідності антиген антитілу), то гемолиз відсутній (позитивна реакція). Якщо в основній системі антиген і антитіло не відповідають один одному, то комплемент фіксується на другому індикаторному комплексі, викликаючи гемолиз еритроцитів (реакція негативна). По чутливості РСК приблизно відповідає реакції пасивної гемагглютинації.

Реакція иммунофлуоресценції (РИФ). У основу иммунофлуоресцентного методу встановлена взаємодія антиген з антитілом, при якому один з компонентів реакції (частіше антитіло) володіє здібністю до повторної флуоресценції завдяки попередньому з'єднанню з флуоресцентним барвником. Імунні комплекси, що стають добре видимими, яскраво світловими структурами на темному фоні під флуоресцентним мікроскопом. Як флуоресцентні барвники використовують флуоресцеин, изотиоцианат, родамин, В-ізотіоцианат, лиссамин-родамин і інші, маючі реакційно-здатні групи (сульфохлорид, изотиоцианат і інш.), які сполучаються з вільними аминогруппами молекул антитіл, не втрачаючи при обробці флуорохромами специфічного скріплення з відповідним антигеном.

Прямий і непрямий флуоресцентні методи. Прямий метод заснований на безпосередньому специфічному з'єднанні антиген з міченими антитілами. Непрямий метод на поетапному виявленні комплексів антиген - антитіло за допомогою флуоресцентних барвників. Перший етап полягає в утворенні імунних комплексів визначеного антиген (наприклад, бактерійної клітки) зі специфічними антитілами (γ - глобулинами) імунної сироватки. Другий етап - у виявленні цього комплексу шляхом обробки його міченим анти- γ - глобуліном.

Виявлення иммуноглобулинов иммунофлуоресцентним методом можливе, якщо антиген, использованньай in vitro для утворення антитіл, являє собою растворимьтй білок. У цьому випадку він може бути конъюгирован з флуорохромом і в такому вигляді використовуватися для виявлення гомологичних антитіл.

Іммуноферментний анали з (ИФА). У основу методу встановлена конъюгация антитіла або гаптена з ферментом, яка не приводить до втрати антитілом або гаптеном специфічності, а ферментом - каталітичної активності. Однак в складі комплексу антиген - антитіло конъюгати гаптен - фермент або антитіло - фермент втрачають свою каталітичну активність.

З'єднання молекул антиген з ферментом здійснюється з допомогою глутаральдегцца - біфункціонального реагенту, взаємодіючого з е-аминогрулпами білкових молекул. Як фермент успішно застосовують в залежність від модифікації методу або пероксидазу, β-галактозидазу, лужну і кислу фосфатази (рідше за ацетилхолин, глюкоамилазу), або лизоцим, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу і малатдегидрогеназу.

Ддя маркіровки антитіл, що Використовується фермент не повинен бути присутній в досліджуваних клітках, вмісних антиген.

Иммуноферментние методи спочатку були розроблені для гистохимических досліджень. Принцип иммуногистохимического аналізу з використанням ферментів полягає в наступному. Антитіла, маркіровані ферментом сполучаються зі специфічним антигеном, фіксованим на твердому носії (полистироловая пластина або інші непористі полімери), утворюючи невидимий комплекс. Виявлення імунних комплексів, вмісних фермент, проводиться допомогою кольорової реакції, що відбувається при додаванні фермеспечифического субстрат. Забарвлений комплекс антиген - антитіло виявляється в світловій або електронній мікроскопії.

Надалі методи иммуноферментного аналізу стали застосовувати для кількісного визначення антигенів і антитіл в біологічних рідинах. Були створені гетерогенні (твердофазние) і гомогенні методи, принципово відмінні способом розділення компонентів иммунохимическои реакції. Гомогенний метод характеризується протіканням реакції антиген - антитіло в гомогенному розчині, і етап фізичного розділення реагентів і продуцентов реакції не обов'язковий. Твердофазние методи засновані на застосуванні антитіл (або антигенів), иммобилизованних на нерозчинних носіях, гомогенні методи - на ефекті модуляції антитілами активності ферменту, пов'язаного з антигеном. У основу гомогенних методів встановлений принцип конкурентного взаимодействил міченого і неміченого гаптена з активними центрами антитіл. Чим більше вільного гаптена введено в реакцію до додавання міченого гаптена, тим менша кількість останнього буде пов'язано з антитілами. Відповідно і ферментативная активність в розчині зміниться трохи. Навпаки, чим менше вільного гаптена ввести в реакцію, тим більша кількість ковалентного сполученого з ферментом гаптена піде в імунний комплекс, а ферментативная активність в розчині істотно знизиться.

Визначення невідомої концентрації гаптена в зразку здійснюють по зазделегідь виведеній калибровочной кривій, для побудови якої встановлюють залежність активності ферменту в даній системі від стандартних концентрацій вільного гаптена.

У твердофазном иммуноферментном аналізі нарівні з конкурентними методами поширені підходи, засновані на послідовній взаємодії фіксованих на носії иммуноглобулинов з антигеном (або навпаки), а потім з иммуноферментним конъюгатом, що являє собою мічені ферментом антитіла проти иммуноглобулинов.

Радіоімунологічний аналіз (РИА). У радіоімунологічному аналізі специфічність реакції антиген - антитіло поєднується з високою чутливістю, що забезпечується застосуванням радіоактивної мітки, завдяки якій можна визначити кількість азоту антитіл до 1 10-8 мг/мл. Для проведення аналізу

необхідно мати антисиворотки і гомологичние антигени, маркіровані яким-небудь ізотопом йода (125, 131), одинаково як і гаптени, маркіровані 14С або ЗН. Чутливість методу істотно зростає при використанні високоаффинних антитіл з низькою перехресною реактивністю і антигенів з високою питомою радіоактивністю. У основу радіоімунологічного аналізу встановлений принцип конкурентної взаємодії визначуваної неміченої антиген і відомої кількості міченої антиген з активними центрами антитіл. При цьому відбувається витиснення міченого антиген або гаптена з його комплексу з антитілом внаслідок подальшого додавання великих концентрацій неміченого антиген або гаптена тієї ж специфічності. Реакція (при високому розведенні інгредієнтів) підкоряється закону діючої маси: витиснення, що відбувається пропорціонально введеній кількості неміченого антиген або гаптена. Конкурендию між визначуваним і міченим антигенами можна оцінити кількісно за допомогою радіометрії, заздалегідь відділивши імунні комплекси, що утворилися від несвязавшегося міченого антиген. Концентрацію визначуваного антиген розраховують, виходячи з порівняння співвідношень вільного і пов'язаного мічених реагентів з відповідним стандартом.