Рис. 19. Зональний електрофорез нормальної сироватки. На електрофореграмме і денситограмме нормальної сироватки видно п'ять основних смуг, які відповідають альбумину, а#61489;, а2, β- і γ - глобулинам

2. Іммуноелектрофорез. Суть методу полягає в наступному: I) проводять електрофоретическое розділення білків в геле; 2) по закінченні електрофореза в геле паралельно напряму електрофореза вирізають борозенки; 3) в борозенки вносять антитіла (антисиворотку), наприклад до важких або легких ланцюгів иммуноглобулинов. Ці антитіла і розділені при електрофорезе білки диффундируют назустріч один одному. У тих місцях, де антитіла зв'язуються з білками, утворяться дуги преципітації. Иммуноелектрофорез дозволяє оцінити лише якісний склад досліджуваної суміші білків. Оцінка результатів дослідження вимагає високої кваліфікації. Частіше за все цей метод застосовується для виявлення і характеристики моноклональних антитіл.

3. Електрофорез з иммунофиксацией. Цей метод заснований на електрофоретическом розділенні білків сироватки в геле з подальшою інкубацією геля в присутності антитіл до важких і легких ланцюгів иммуноглобулинов. При скріпленні білків з антитілами утворяться імунні комплекси, які можна побачити після фарбування. Імунні комплекси, вмісні нормальні иммуноглобулини відкладаються у вигляді широкої, розмитої смуги, моноклональние - у вигляді більш вузької і чітко окресленої. Цей метод також є якісним, однак більш чутливий і простий, ніж иммуноелектрофорез. Електрофорез з иммунофиксацией часто застосовується в поєднанні з иммуноелектрофорезом для визначення моноклональних або олигоклональних иммуноглобулинов.

Рис. 20. Иммуноелектрофорез сироватки здорового (3) і хворого з моноклональной гаммапатией (БИ), що супроводиться підвищенням рівня γ - і до- ланцюгів. Антитіла до γ - і до-ланцюгам утворять більш широкі дуги преципітації з сироваткою хворого, чим з сироваткою здорового (Г. Лолор, Т. Фішер, 2000).

Рис. 21. Електрофорез з иммунофиксацией (нормальна сироватка). На смужках геля видно розмиті смуги преципітації, відповідні важким (γ)(, а і m) і легким (до і l) ланцюгам иммуноглобулинов. Важкі і легкі ланцюги моноклональних иммуноглобулинов відкладаються у вигляді більше за вузькі і чітко окреслені смуги (на малюнку не показано). Контроль - електрофорез нормальної сироватки без иммунофиксації (Г. Лолор, Т. Фішер, 2000).

Б. Двойная радіальна иммунодиффузия- полуколичественний метод, за допомогою якого можна не тільки виявити антигени, але і оцінити міру схожості між ними. Суть методу полягає в наступному: 1) в лунка, вирізану в агаре, вносять досліджувану суміш антигенів і антитіла з відомою специфічністю (звичайно в центральну лунка вносять антитіла, а в розташовані навколо неї - антигени); 2) антигени і антитіла диффундируют у напрямі друг до друга; 3) в тому місці, де сталося скріплення антитіл і антигенів, утворяться смуги преципітації. По взаємному розташуванню і формі смуг преципітації можна оцінити міру схожості між антигенами, що знаходяться в сусідній лунка. У цей час цей метод застосовується в діагностиці аутоиммунних захворювань для виявлення аутоантител до ядерних антигенів, що екстрагуються. Хоч по чутливості метод двійчастий радіальної иммунодиффузії поступається багатьом кількісним методам, технічно він простий, не вимагає високоочищенних антитіл, специфічний і може використовуватися при проведенні масових досліджень.

В. Простая радіальна иммунодиффузияпозволяетколичественноопределить зміст антиген в досліджуваній пробі. Суть методу полягає в наступному. У шарі агара, вмісного антитіла, вирізають лунка, в одні з яких вносять досліджуваний антиген, в інші - стандартний. Антигени диффундируют з лунка в агар, утворюючи радіальні зони преципітації. Діаметр зони преципітації пропорційний концентрації антиген. Це простій і надійний метод кількісної оцінки иммуноглобулинов (включаючи підкласи IgG), компонентів комплемента (наприклад, СЗ, С4, чинника В) і інших білків сироватки. Існують готові набори, що дозволяють визначити антиген в низькій концентрації - не більше за 3 мкг/мл. Визначаючи зміст иммуноглобулинов, необхідно враховувати, що зміна їх властивостей може спотворювати результати дослідження. Так, якщо в сироватці содержатсямономерние IgM(наприклад, при макроглобулинемії Вальденстрема, атаксии-телеангиектазії), рівень IgM буде штучно завищений, оскільки мономерний IgM диффундирует швидше, ніж пентамерний. Присутствиеревматоидного факторав досліджуваній пробі, навпаки, штучно знижує рівень IgG, оскільки імунні комплекси, що складаються з IgG і ревматоидного чинника, диффундируют повільніше, ніж непов'язаний IgG. Сироватка багатьох хворих з дефіцитом IgA содержитантитела до білок тваринного походження, наприклад до козиним иммуноглобулинам, тому при використанні козиних антитіл для визначення рівня IgA в цьому випадку виходять завищені результати.

Техніка реакції: Розведення (титр) моноспецифической антисиворотки. яке забезпечує чітке кільце преципітації зі стандартною сироваткою, вказується підприємством-виготівником. При цьому розведення моноспецифических сироваток підбирають таким чином, щоб з суцільною стандартною англобулиновой сироваткою формувалося кільце: діаметром 11 - 12 мм з анти-lgA-сироваткою 8 - 9 мм і анти-lgM-сироваткою - 6 - 7 мм. У кожній серії дослідів стандартну моноспецифическую сироватку з відомим змістом иммуноглобупинов випробовують в розведенні 1:2, 1:4, 1:8, суцільна. Приготований 2% агар на буфері перед досвідом розтоплюють на киплячій бані, потім вміщують в термостат при 48°С. Колічество агара, необхідне для одного скла розраховують таким чином, щоб товщина застиглого шара була 1 - 2 мм. Моноспецифические сироватки розводять тим же буферним розчином з розрахунку вдвоє менше вказаних титрів і нагрівають на водяній бані до 50°З, Після цього розведення антисиворотки ретельно змішують з агаром в рівному об'ємі. Суміш агара з антисивороткой розливають на заздалегідь підігріте скло, лежаче суворо горизонтально. Після застигання агара в ньому металевим штампом з внутрішнім діаметром 2 мм вибивають лунка на відстані 1 - 1,5 см один від одного. Чотири першу лунка заповнюють сироваткою в різному розведенні (суцільна, 1:2, 1:4, 1:8), в інші вносять випробувані сироватки. Щоб уникнути помилок при обліку результатів лунка заповнює дуже акуратно з допомогою микрошприца або капіляра. Скло вміщує у вологу камеру при кімнатній температурі. Облік результатів проводять через 24 години для иммуноглобулинов G і А, через 48 годин для IgM.

Облік реакції: По закінченні часу реакції вимірюють діаметри кілець преципітації, що утворилися. На графіку по осі ординат відкладають квадрати радіусів кілець преципітації, а по осі абсцис - відома кількість иммуно-глобулинов (г/л), що містяться в еталонній сироватці відповідного розведення. Отримані точки з'єднують прямий. Вміст иммуноглобулинов у випробуваному зразку визначають по побудованій прямій, окремій для кожного класу иммуноглобулинов.

Г. Нефелометрія- визначення концентрації зважених частинок і високомолекулярних речовин в розчині, засноване на оцінці інтенсивності розсіяння світла, що проходить через цей розчин. Нефелометрия може бути використана для визначення концентрації антигенів, оскільки при додаванні до них антитіл утворяться імунні комплекси, розсіюючі минаюче світло. Нефелометрия дозволяє з високою точністю визначити концентрацію IgG, IgA, IgM, підкласів IgG, СЗ, С4, чинника В, З-реактивного білка і деяких інших сивороточних білків. Цей метод підходить для визначення білків в низькій концентрації, наприклад IgE, рівень якого в сироватці не перевищує 1 мкг/мл. У цей час багато які лабораторії використовують нефелометрию як стандартний метод кількісного визначення иммуноглобулинов.

Д. Радіоїммунний аналіз. Цей високочутливий метод розроблений більше за 30 років тому і спочатку використовувався для визначення концентрації інсуліну і інших гормонів. Зараз він використовується і для визначення антигенів і антитіл. Існує декілька модифікацій методу. Одна з них заснована на конкурентному скріпленні міченого радіоактивним ізотопом і неміченого антиген з антитілами. Суть методу полягає в наступному: 1) відому кількість антитіл змішують з відомою кількістю міченого антиген і досліджуваною пробою (вмісної невідому кількість антиген); 2) антиген, що міститься в пробі, і стандартний мічений антиген зв'язуються з антитілами; 3) чим вище зміст неміченого антиген, тим менше міченого антиген зв'яжеться з антитілами. Концентрацію антиген в досліджуваній пробі оцінюють по рівню радіоактивність імунних комплексів. Той же підхід може бути використаний для визначення концентрації антитіл в пробі. У цьому випадку відома кількість антиген змішують з відомою кількістю стандартних мічених антитіл і досліджуваною пробою (вмісної невідому кількість антитіл). Інша модифікація методу заснована на иммобилизації антиген або антитіла на твердій підкладці. Основні нестачі методу - необхідність обладнання, що дорого коштує і реактивів, а також умов для роботи з радіоактивними ізотопами.

Е. Твердофазний иммуноферментний аналіз. Як тверда фаза частіше за все використовуються полистироловие планшети з сорбированними на них антигенами або антитілами. Визначення антитіл до якого-небудь антигена проводять таким чином: 1) досліджувану рідину вносять в лунка планшета з сорбированним на них антигеном; 2) під час інкубації антитіла зв'язуються з антигеном; 3) планшет відмивають від несвязавшихся антитіл і додають антитіла до иммуноглобулинам (другі антитіла), мічені ферментом; 4) планшет знову відмивають, додають субстрат ферменту і хромоген (речовина, що міняє забарвлення в процесі хімічної реакції); 5) під дією продукту ферментативной реакції хромоген міняє забарвлення. Чим більше мічених ферментом других антитіл зв'язується з комплексами антиген-антитіло, тим вище активність ферменту і інтенсивність забарвлення розчину. Концентрацію антитіл в пробі визначають спектрофотометрически - по оптичній густині забарвленого розчину. Такий же підхід застосовується для визначення антиген в пробі. У цьому випадку використовуються планшети з сорбированними антитілами до досліджуваного антигена, мічені ферментом другі антитіла також направлені до цього антигена (мал. 20.5). Твердофазний иммуноферментний аналіз застосовують для кількісної оцінки антитіл і антигенів. По чутливості він зіставимо з радиоиммунним аналізом, але більш простий, дешевий і не вимагає застосування радіоактивних ізотопів. Багато які лабораторії використовують твердофазний иммуноферментний аналіз як стандартний метод визначення противовирусних антитіл, включаючи антитіла до ВИЧ, цитокинов і иммуноглобулинов (IgE і підкласів IgG).

Рис. 22. Твердофазний иммуноферментний аналіз. А. Определеніє антитіл. Б. Определеніє антигенів. При радиоиммунном аналізі як мітка використовується радіоактивний ізотоп, при иммунофлюоресцентном аналізі - флюорохром (Г. Лолор, Т. Фішер, 2000).